AKTA层析系统标准操作规程浅谈

在使用AKTA前,请先阅读本规程,并了解所需层析方法的
原理。初次使用请在有经验的人指导下进行。 
一. 缓冲液和层析的样品的准备: 
1. 溶液需用去离子水、超纯水或注射用水配制,除NaOH和乙醇外,所有
用于层析的缓冲液需经0.45μm孔径的滤膜过滤,并盛装于用0.45μm孔径滤膜过滤的水**少荡洗4次的容器中。 
2. 实验过程中用到的20%乙醇应用新的无水乙醇和0.45μm孔径滤膜过滤的
水配制;0.1M NaOH用0.45μm孔径滤膜过滤的水和固体NaOH配制。 3. 盛装缓冲液的应使用小口有盖圆底容器,**好可灭菌,如蓝口瓶,无水
乙醇瓶。烧杯(敞口,易污染长菌)、血清瓶(多死角,易长菌)不适合用于盛装缓冲液。 
4. 配制的缓冲液成分不宜浓度过高,如硫铵不得超过2M(约50%饱和硫铵);
NaCl不得超过4M;PB不得超过500mM;以免析出固体损坏层析介质与仪器。 
5. 缓冲液要多次使用,需在120℃灭菌20min,此后置于4℃保存,下回层
析时平衡**室温使用,使用前应摇晃无可见异物方可使用,否则,应重新过滤。 
6. 用于层析的样品通常要用12000rpm离心10min,上清用0.22μm过滤后才
可以用于层析。经过层析后收集的样品如无沉淀可免去离心和过滤的步骤。7. 用于离子,疏水层析的样品应经预实验不会在该层析条件下样品在低盐
和高盐条件下稳定不析出沉淀。 
二. AKTA仪器的使用: 
1.开关机 
⑴开启电脑,检查电脑运行状态是否正常。 
⑵开启AKTA总电源按钮(AKTA仪器一般分为2-3个模块,每个模块有单独的电源开关,通常为开启状态,总电源开关一般用于开关仪器),稍后开启AKTA控制软件UNICORN,并等待仪器自检和联机,每个模块自检成功后会发出“嘀---嘀嘀”的声音,相应在仪器上显示自检通过的字样。软件开启后会同时打开4个界面,从左到右依次是:文件管理界面、程序编辑界面,仪器控制界面,图线分析界面。与仪器连接成功后,仪器控制界面下方仪器简图线路变成绿色,仪器会从泵内走一段液体**废液。如未连接成功,操作界面会弹出提示窗口,此时请检查仪器与电脑数据线插头是否松动,而后关闭仪器和程序,重新开启,必要时可重新启动电脑。如经过以上步骤还无法连接,请联系管理员。 
⑶使用完仪器应在文件管理界面关闭UNICORN程序,系统将提示是否锁定界面,选否,待UNICORN完全退出后方可关闭仪器电源。使用完毕后需清理台面,并登记使用事项。 2.AKTA仪器的运行⑴在打开流速之前,将AB管道插入缓冲液中,遵循A低盐,B高盐或者A高pH, B低pH的原则,若只用一种缓冲液,请将AB管道都插入缓冲液中,然后AB泵各走50%。在装上柱子之前应先用高流速将管道中替换成自己相应缓冲液。 
⑵若样品量低于10mL,用上样环进样比较简便和准确。选用合适上样环,在装柱前连接上仪器,在清洗管道时调**inject一并清洗,并且装上层析柱后随柱子一起平衡。上样时,先在inject下插入注射器,调**load,打入缓冲液,改为inject,上样。 
⑶在仪器控制界面可通过电脑控制流速,A/B泵流速比例,上样环状态切换,UV归零,压力上限,以及标注和定时暂停等。流速和压力控制要按照不同的介质、柱型号的使用方法严格严格执行(参数见附表)。特别需要注意的是,在使用时要设定**高压力警报,以避免操作不当造成柱子爆裂,甚**仪器损坏。AKTA使用过程中请检查各部分的运行情况,如有问题及时联系管理员。 
⑷同时,在使用时,请确保位于仪器一侧的,50mL管装的20%乙醇正在循环流动(用于清洗压力泵),并且20%乙醇无浑浊或干涸现象。若发生断流或液体浑浊,请及时更换并用注射器抽取,让液体充满管道,避免对压力泵造成损害。 
⑸使用NaOH以及盐浓度较高的缓冲液清洗管道或柱子时尽量减少漏液,如漏到仪器上时请及时擦拭干净,避免腐蚀AKTA。柱子使用完后要及时拆卸,以便他人使用。注意柱子拆卸后要在相应接口连接一条管道,避免污染杂质,染菌或检测探头由于缓冲液干涸盐析造成损坏。 
⑹当发现压力检测器或pH计不准时,及时通知管理员进行校正。 ⑺运行结束后请及时保存实验结果,并归于各人自己目录下,便于整理和存档。 
三、层析柱和介质的使用: 
1.装柱 
⑴原先在溶液中的介质通常可以用水或乙醇(20%)装柱,干粉介质(如G25)需在水中溶胀1h以上,方可装柱。CHTII需在200mM PB溶液中溶胀1h后,用200mM PB装柱。 
⑵拆下柱子,清洗柱腔和管道,将位于下方的一端(较短的)接上AKTA仪器,揭下防水膜,以5~10mL/min流速排出防水膜下的气泡,盖上防水膜,装上柱腔,继续在柱腔底部注满2cm左右的溶液,将计算好体积的介质贴壁缓慢倒入柱腔内,要防止气泡的产生。将管道从仪器上卸下,让溶液流出,介质随着沉降。当介质沉降完全后,堵上下端出口。 
⑶将位于上方的一端接上仪器如⑵排去气泡后,向柱腔内缓慢注水**上柱面,将上端插入柱腔,锁在介质面上方约1cm处。 

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