离子交换树脂命名 ● ● ● ×● 离子交换树脂命名 强酸性 （001-099） 弱酸性（100-199） 强碱性 （200-299) 弱碱性 （300-399）
（4）色泽：普通凝胶型树脂是透明的球珠，大孔树脂呈不透明的雾状球珠。随合成原料、工艺条件不同，树脂的颜色也有所不同，一般有黄、白、黄褐、红棕等几种颜色。
动态：离子交换柱，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行，亦称为离子交换层析法, 操作连续、交换完全，适宜多组份分离
柱式固定床（Fixed－Bed） 模拟移动床（SMB） 离子交换操作步骤 1 树脂的选择 2 树脂预处理 3 装柱
4 离子交换吸附 5 洗脱 6 再生
1 树脂的选择
2 树脂预处理
物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒； 化学处理：转型
阳离子树脂 酸—碱—酸 阴离子树脂 碱—酸—碱
**后以去离子水或缓冲液平衡
3 离子交换吸附
溶液中待交换离子与树脂上的活性离子发生交换反应的过程 使尽可能多的待交换离子吸附到树脂上，同时保证其选择性
4 洗脱
离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法 洗脱条件选择原则
（1） 与吸附条件相反 （2） 缓冲液 （3） 缓和酸碱 （4） 有机溶剂
洗脱一般采取梯度淋洗：先采用洗脱能力弱的溶液，使易洗脱组分流出，然后依次使用洗脱能力更强的溶液，洗脱较难洗脱的组分。
5 树脂再生
离子交换树脂(IONRESIN)使用一段时间后，吸附的杂质接近饱和状态，就要进行再生处理，使之恢复原来的组成和性能
树脂的再生特性与它的类型和结构有密切关系。
强酸/强碱树脂再生比较困难，再生剂量比理论值高相当多； 弱酸/弱碱性树脂则较易再生，再生剂量只需稍多于理论值。
大孔型和交联度低的树脂较易再生，而凝胶型和交联度高的树脂则要较长的再生反应时
间。
在实际运用中，为降低再生费用，使树脂的性能恢复70～80%。再生剂的种类应根据树脂的离子类型来选用，并适当地选择价格较低的酸、碱或盐。
钠型阳树脂可用NaCl溶液再生，用量为其交换容量的2倍 ； 氢型阳树脂用强酸再生，盐酸或硫酸
氯型碱性树脂，主要以NaCl 溶液来再生，但加入少量碱有助于将树脂吸附的色素和有
机物溶解洗出。 #p#分页标题#e#
OH型碱阴树脂则用4%NaOH溶液再生。
腺苷蛋氨酸(SAM)的纯化流程 腺苷蛋氨酸(SAM)的纯化流程
第五节 凝胶柱层析
利用凝胶层析介质(固定相)交联度的同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。
一、凝胶层析的原理
固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。
二、凝胶的种类 1.葡聚糖凝胶 2.琼脂糖凝胶 3.聚丙烯酰胺凝胶
三、凝胶柱层析的操作与应用
（一）凝胶柱层析的操作特点 1、凝胶柱层析优点：（1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；（2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；（3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；（4）设备简单，分离机理简单，易于操作；（5）样品回收率高，几乎可达100%。 2、凝胶层析的缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。
（二）凝胶柱层析的特点与应用 （1）主要用于脱盐 （2）类分离 （3）分级分离
（4）生物大分子分子量的测定
第六节 疏水层析(hydrophobic chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。 一、疏水层析的原理
亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。
二、疏水性吸附剂
各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
三、疏水柱层析的操作与应用
（一）疏水柱层析的操作特点 1、层析柱的制备 2、平衡
3、加样与洗脱 4、再生
（二）疏水柱层析的特点与应用 1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加样量大；（3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
2、疏水柱层析应用：疏水柱层析适用于分离的任何阶段，尤其是样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。
第七节 亲和层析(affinity chromatography)
在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析
亲和柱层析的原理 一、亲和柱层析的原理
（一）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；
（二）吸附样品：亲和吸附介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；
（三）样品解析：选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解吸
二、亲和吸附介质
用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗粒，特别是琼脂糖和交联葡聚糖，但也用合成的聚丙烯酰胺凝胶、纤维素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。 选作配基的分子必须具有适当的化学基团，该基团不参与配基与生物分子的特异结合，但是
却可以用来连接配基与载体。
将亲和配基共价偶联在载体的表面，即可制得亲和吸附介质。一般凝胶过滤介质均可作为亲和配基的载体来制备亲和吸附介质。
三、亲和柱层析的操作与应用
（一）亲和柱层析的操作特点
1．基本过程 （1）进料吸附 （2）杂质清洗 （3）目标产物洗脱 （4）层析柱再生
（二）亲和层析的特点与应用 #p#分页标题#e#
1、亲和层析的特点：在生物制品分离和分析*域有宽广的应用开发前景。由于其具有简便、快速、专一和高效等特点，亲和层析的应用十分广泛，已普及到生命科学的各个*域。 2、亲和层析亲和层析的应用： （1）分离和纯化各种生物分子 （2）分离纯化各种功能细胞
（3）用于各种生化成分的分析检测
第八节 分配柱层析
一、分配柱层析的基本原理
分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。
固定在柱内的液体叫固定相，用作冲洗的液体叫流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体来吸牢它，这种固体本身不起什么分离作用，也没有吸附能力，只是用来使固定相停留在柱内，这种固体叫载体。
进行分离时先将含有固定相的载体装在柱内，加少量被分离的溶液后，用适当溶剂进行洗脱。在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，容易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动就慢，因此得到分离。
二、分配柱层析的载体
（一）硅胶
吸水量为50%时仍为粉末状，当其吸水量在17%以上时，硅胶就失去其吸附作用，作为载体使用，此时硅胶层析则为分配层析。 （二）硅藻土
具有微孔结构，不具吸附作用，是现在使用**多的载体。其处理和装柱方法基本同硅胶相似 。
（三）纤维素
三、分配柱层析的固定相与展开剂 （一）固定相
常用的固定相有水、各种缓冲溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及为水所饱和的有机溶剂等。有时也采用¡°反相层析法¡±，即用有机溶剂为固定相，而以水或水溶液或与水混合的有机溶剂为流动相。 （二）展开剂
流动相一般用为水所饱和的有机溶剂或水一有机溶剂互溶的混合液，一般常用的流动相溶剂有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯类等，或它们的混合物。反相层析法常用的流动相，则为正相层析法中的固定相，如水、各种水溶液（包括酸、碱、盐与缓冲液）、低级醇类等。
三、分配柱层析的基本操作 （一）装柱
装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤维素等载体时，可以直加固定相直接混合，用硅藻土为载体先把硅藻土放在大量流动相液体中，在不断搅拌下，逐渐加入固定相。 （二）加样
1、将被分离物配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加到含固定相载体的上端，然后加流动相洗脱；
2、被分离物溶液用少量含固定相的载体吸收，溶剂挥发后，加在层析管载体的上端，然后加流动相洗脱；
3、用一块比管径略小的圆形滤纸吸附被分离物溶液，溶剂挥发后，放在载体上，然后加流动相洗脱。
四、分配柱层析的特点与应用
（一）特点：
分配柱层析具有载体来源容易、分离成本低、流速快等特点,适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。 （二）应用：
分配柱层析多用于分离亲水性的成分，如苷类、糖及氨基酸类。
实验十 胡萝卜素的柱层析分离 一、实验准备
（一）实验原理及目的 1、原理
本实验采用氧化铝为固定相的吸附层析。各种物质具有不同的吸附力， 胡萝卜素存在于胡萝卜、辣椒等黄绿色植物中，由于在动物体内可将胡萝卜素转变为维生素A，故又称维生素A原。胡萝卜素（属多烯色素类，又可分为α、β、γ等几种类型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，并能被氧化铝所吸附。由于胡萝卜素与其他植物色素的化学结构不同，它们在有机溶剂中的溶解度以及被氧化铝吸附的强度也不相同，故将抽提液进行氧化铝柱层析，再用石油醚等冲洗层析柱，即可将植物提取液中混合的胡萝卜素分离成不同的色带。同植物其他色素相比较，胡萝卜素的极性**小，吸附**差，用石油醚洗脱速度**快，故被**先洗脱下来，使胡萝卜素与其他色素分开。同时也可将胡萝卜素层析带洗脱下来进行比色定量。
2、目的
（1）了解柱层析的基本原理
（2）掌握胡萝卜素分离的操作方法 （二）试剂及器具 1、材料
新鲜红辣椒、氧化铝（Al2O3，高温烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、试剂
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95%乙醇、无水硫酸钠、石油醚（沸点60～90℃）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；体积比）、三氯化锑氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100ml氯仿溶解后，贮于棕色瓶中）。 3、器具
剪刀、研钵，层析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，铁架台及蝶形夹，蒸发皿，恒温水浴，天平，烧杯、软木塞、棉花、胶头滴管、滤纸、试管 二、实验过程
乙醇 石油醚 蒸馏水 硫酸钠
红辣椒 研磨 研磨 洗涤 提取液 除水 上样 层析 收集洗脱液 鉴别 三、注意事项
（一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏植物细胞，使胡萝卜素释放更完全。丙酮可增强分离效果，有利于对胡萝卜素的提取，若分离条件控制得好，可依次提取、分离得到α胡萝卜素，ß胡萝卜素、γ胡萝卜素，以及紧随其后的是辣椒红素，番茄红素及叶黄素等植物色素。
（二）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡，氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的3/4，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整，若上端不平，影响分离效果而产生不规则的条带。
三）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中jue不能使氧化铝表面的液体流干。
（四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮肤。三氯化锑遇水生成碱式盐，再转变成氯氧化锑，此化合物与胡萝卜素不发生颜色反应，而出现浑浊。
（五）石油醚提取液中的乙醇必须洗净，否则吸附不好，层析中色带也弥散不清。 （六）层析柱底部棉花的用量不宜过多，松紧要适宜，否则将影响流速。
实验十一 离子交换色谱分离混合氨基酸 一、实验准备
（一）实验原理及目的 1、原理
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。在pH=5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2、目的
(1)、了解离子交换树脂分离氨基酸基本原理 (2)、掌握阳离子交换树脂处理技
（二）试剂及器具 1、材料
磺酸型阳离子交换树脂（732型） 2、试剂
树脂处理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。 3、器具
离子交换色谱柱、量筒、吸管、收集器、试管、
恒流泵。 二、实验过程
树脂处理、转型 装柱 平衡 上样 洗脱 收集 测定
三、注意事项
（一）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡。
（二）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中jue不能使树脂表面的液体流干。
（三）一直保持流速10滴/min～12滴/ min，并注意勿使树脂表面干燥。
实验十二 凝胶柱层析分离蛋白质 一、实验准备
（一）实验原理及目的 1、原理： 凝胶层析（gel chromatography）是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在层析柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出层析柱，达到分离纯化的目的。 #p#分页标题#e#
本实验主要学习葡聚糖凝胶柱层析分离（凝胶过滤）的基本操作技术环节，如柱层析填充介质（凝胶）的溶胀、装柱、平衡、洗脱等。
2、目的：
（1）熟悉凝胶层析分离的基本原理；
（2）掌握凝胶柱层析填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术 （二）试剂及器具 1、材料 Sephadex G-50（或G-75）、蓝色葡聚糖2000、牛血清蛋白 2、试剂
磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。
缓冲液的配制方法：先称取一定量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，用去离 子水分别溶解、配制成3L浓度为0.1mol/L的溶液，然后将这两种溶液边按一定比例混合，边用酸度计检测，调配成pH7.0的磷酸盐缓冲液 3、器具
酸度计、层析柱（1.6cm×30cm）、铁架台、试管（多个）紫外分光光度计或
紫外检测仪、电炉、容量瓶（1L）、烧杯、三角瓶、滴管、移液管、电子天平、玻棒、塑料壶（3~5L）。 二、实验过程
凝胶溶胀 装柱 平衡 加样 洗脱 绘制曲线 三、注意事项 （一）层析柱大小可根据实际需要选择，一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，**好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生管壁效应，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
（二）装好的层析柱凝胶要均匀，不能有断层或纹路或气泡，将柱管对着光照方向观察，若层析柱床不均匀，必须重新装柱。
（三）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
（四）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变差，不得不重新装柱。 （五）洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。
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