BPG 层析柱标准装柱流程规范介绍

目的:为了使BPG300层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好的柱效,故建立此操作规范。 
范围:配合ÄKTA process系统进行有效的蛋白质纯化操作。 责任人:层析工序操作人员 标准操作程序: 1 基本术语概念 
填料因子(Packing Factor, PF):指在在装柱过程中,用低流速(如60cm/h)对填料进行沉降压缩得到的调料高度和**后装柱完成时填料高度(柱高)的比值,
线性流速(linear flow rate):单位时间内液体流经的直线距离,常用cm/h表示; 
体积流速(volume flow rate):单位时间内液体流经的空间容积,常用ml/min表示;

2 准备工作 
2.1 检查层析柱的完整性,所带配件,是否水平(用水平仪矫正),是否清洁(如有污染应进行清洗)。 2.2 确定所用填料及其特性、浓度等 
以DEAE Sepharose Fast Flow填料为例,其填料因子(PF)为1.15,新填料(slurry)浓度为75%(保存于20%乙醇中),耐压3bar。 2.3 确定放大后的工艺参数 
以XX生化制药股份有限公司的放大工艺为例, 中试工艺参数: 
柱高h=10cm;体积流速v1=3ml/min;柱内径d=1.6cm. 即,线性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82) cm/min=1.5 cm/min; 样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min; 
在工艺的线性放大中h、v2和t均不变,则可保证样品出峰的位置(洗脱时间)和形状不变。 
使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数: 装柱体积V柱= S柱h=3.14×1.52×1L=7L; 装柱需要slurry体积Vslurry=V柱×PF/Cslurry 以DEAE Sepharose Fast Flow为填料, 则,Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L; 
装入柱中的slurry高度Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14×1.52)dm=1.52dm=15.2cm. 3管路安装 
3.1 层析柱管道和配件安装 
3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或20%乙醇充分浸润柱内壁和柱头O型圈; 
3.1.2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝,并通过旋转高度调节手柄将柱头旋****高处,在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀,在柱底安装四路二通阀; 
3.1.3在顶部四路二通阀上横向连接一根细管,另一端连**ÄKTA process上端连接口COLUMN TOP,同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管**ÄKTA process的下端连接口COLUMN BOTTOM。


3.2层析柱下端筛网排气泡 
3.2.1连接两根足够长的细管到ÄKTA process进样泵的A1和B1进口,两管另一端均放入纯水中; 
3.2.2从A1泵入纯水:打开UNICORN软件,在system control窗口点击manual→valves→InletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;
Column,选择upflow,insert;Pump→Flow,设定流速60L/h,点击execute运行程序充水**BPG柱中2-3cm左右,pause,清除下端筛网中的空气,用注射器吸出筛网中残留的气泡。 4装填料 4.1准备填料 
所用填料为DEAE Sepharose Fast Flow ,装置的是保存于20%乙醇中的新slurry; 
4.2卸下柱头,用搅拌棍引流加入混匀的slurry**15.2cm处,再加入纯水**40cm左右,充分搅拌混匀,同时避免挤压筛网和柱壁,静置使填料界面**少低于38cm; 
4.3在system control窗口点击manual→valves→InletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择downflow,insert;Pump→Flow,设定流速60L/h,点击execute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡,再装上柱头,用密封调节器固定柱头,拧紧螺丝; 
4.4在system control窗口点击manual→Pump→Flow,设定流速为42L/h(60cm/h),进行填料的沉降,待填料高度降**14cm左右,将密封调节器旋**全松,将柱头快速调**距离填料3-4cm处,将密封调节器旋**半松,将柱头快速调**滤网距离填料1-2cm,旋紧密封调节器,再设定高流速(如150L/h),继续压缩填料,**后再调节柱头**10cm。整个过程一直有流速,泵速不能停。 5 柱效测定

图2、柱效测定示意图 
5.1 平衡 
    将A1接口细管放入0.4M NaCl溶液中,将柱顶端四路二通阀调**管路与大气相连状态,在system control窗口点击manual→valves→InletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择downflow,insert;Pump→Flow,再设定高流速(如150L/h),点击execute运行,排气泡,再将阀调**管路与柱头相连状态,平衡3-5个柱体积**电导曲线稳定,点击END; 5.2上样 
5.2.1将B1接口细管放入2M NaCl溶液,柱顶端四路二通阀调**管路与大气相连状态,在system control窗口点击manual→valves→InletA,选择Closed,insert;InletB,选择InletB1,insert;Column,选择downflow,insert;Pump→Flow,设定高流速(150L/h)点击execute运行,排气泡,pause; 
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