GST亲和层析介质使用说明书介绍

一、   简介  
GST亲和层析介质(GST Agarose)是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质,一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白,纯化条件温和,可以保证蛋白的活性。  
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性,使用寿命长,操作方便,批次重复性好,易于放大,是研发与生产的理想选择。 二、   性能参数

三、   适用范围  
分离谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、   操作说明 1.  缓冲液配制 
       缓冲液A(平衡缓冲液):10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,调节pH值**8.0。        缓冲液B(洗脱缓冲液):10mM Glutathione(还原型),50mM Tris-HCl,调节pH值**8.0。因Glutathione易氧   化,需现用现配。 
(注:各种溶液配制完毕后,**好进行脱气处理,0.45 μm滤膜过滤备用)。 2.  样品预处理:按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体;600w功率,每循环超声3s,冷却3s,循环99×3次,破碎菌体;4℃、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0.45μm滤膜过滤。 3.   装柱:        聚苯乙烯层析柱 
1)  将层析柱固定在铁架台或层析架上,封闭层析柱下端出口,向柱内充入纯水,排开层析柱内空气,先将垫片完全浸没于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部,避免垫片下方滞留气泡。 
2)  打开层析柱下端出口,排出柱中纯水;在液面低**距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。 
3)  从上端管口将另一垫片缓慢推**介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验结果要求不严,也可不放入上垫片,以提高流速)。 
4)  在使用一段时间后,如果层析柱流速减慢,可先用小镊子沿边缘将垫片推翻,夹出垫片,倒出介质,清洗或更换新的垫片后,按2)、3)所述      玻璃层析柱 
1)  将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上;向柱中加入蒸馏水,排开柱子中的空气,在蒸馏水排尽以前,关闭柱子出口,在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。  
2)  先将介质混匀,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。 
3)  从上端管口将转换杆出液端缓慢推**介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 
4)  在使用一段时间后,如果流速减慢,可先卸下上转换杆,将介质倒出,再取出下转换接头中滤网,清洗或更换后重新装柱。 4.  过柱: 
1)  用10倍介质体积缓冲液A过柱,平衡介质;
 
 
2)  上样; 
3)   用5~10倍介质体积缓冲液A过柱,洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质; 4)   用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱,收集洗脱液;  5)   用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。 
注:纯化过程流速不宜过快,对于1ml介质,流速保持在0.5ml/min为宜。 5.  介质清洗  
如果在使用一段时间后,介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降,需对介质进行清洗。步骤如下: 1)  沉淀或变性物质的清洗: 
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗,然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。 2)  疏水缔合物质的清洗: 
用3~4倍介质体积70%乙醇 (或2倍介质体积去垢剂,如 1% Triton™ X-100) 清洗介质;然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。 6. 介质再生 
每次层析前,为达到**佳纯化效果,需对介质进行再生,步骤如下: 
1)  2倍介质体积高pH缓冲液(0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5)和低pH缓冲液(0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5)交替洗脱三次。 
2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。 7.   SDS-PAGE检测:  
1)   不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围 
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A.    每个胶孔**适蛋白上样量为5~10μg。  
B.    将含5~10μg蛋白的样品溶液与loading buffer混匀,90℃孵育5min,取出后5000rpm离心1 min。 C.    上样,15mA、30mA恒流或80V、120V恒压电泳。 8.介质保存 
4℃~8℃条件下,介质可长期保存于20%乙醇中。 五、   GST Agarose分离GST融合蛋白实例 
         层析介质:GST 1ml;对照GST介质(国际**品牌)1ml 
         样品:表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液 
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