蛋白质的分子筛层析实验介绍

一、目的 
 
(1)掌握从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的方法。 
(2)了解凝胶层析法的工作原理,掌握其基本操作技术。  
二、原理 
 
鸡卵类黏蛋白是一种糖蛋白,存在于鸡蛋清中。它在中性或偏酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都有较高的耐受性,但在碱溶液中不稳定。在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍然有较好的溶解度。通常选择合适的pH值及适当浓度的丙酮或三氯乙酸,可以从鸡蛋清中除去非卵类黏蛋白,从而达到纯化鸡卵类黏蛋白的目的。 
凝胶过滤又叫分子筛层析。分子筛指的是多孔介质,这种介质具有立体网状结构,内部充满孔隙,孔径虽大小不一,但有一定范围。当含有不同相对分子溶质的混合物流经这一介质时,小分子物质能进入介质内部空隙,而大分子物质被排阻在介质之外。这样,不同相对分子质量的溶质分子质量的溶质分子在凝胶层析过程中的移动速度不同,从而得到层析分离。 
可作为凝胶过滤的介质很多,如交联葡聚糖(商品名Sephadex)、交联琼脂糖(商品名Sephearose)、聚丙烯酰胺凝胶等。 
将经过充分溶胀处理的凝胶装柱,再将含有不同相对分子质量溶质的样品液上柱,并用同一溶剂洗脱展开,就可实现各溶质分离。凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kav表示:

(9)布氏漏斗 (10)抽滤瓶 (11)滤纸 
(12)冷冻离心机 
(13)层析柱(3.5㎝×30㎝) (14)紫外分光光度计 (15)分部收集器 (16)真空泵 (17)真空干燥器  
四、材料与试剂 
 
(1)新鲜鸡蛋 
(2)葡聚糖凝胶sephadex G-25(50~100目) (3)丙酮。 
(4)0.5mol/L三氯乙酸(TCA) 
(5)0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)取磷酸氢二钠和磷酸二氢钾分别把它们配制成0.02mol/L的溶液,再按一定量的比例制成pH6.5 
 
五、操作方法 
 
1.卵类黏蛋白的抽提 
(1)取鸡蛋一只,在其底部轻磕一小洞,使蛋清沿小洞慢慢流下,将蛋清液收集到一烧杯中(注意不要使蛋黄混入)。取鸡蛋清50mL,在30℃水浴中,缓慢加入等体积的0.5mol/L三氯乙酸-丙酮溶液(三氯乙酸:丙酮=1:2),边加边搅拌,约30min加完,**后溶液的pH=3.5,继续搅拌30min,置于冰箱中静置4h以上。 
(2)2 500r/min,4℃离心20min,弃去沉淀,清液再用滤纸过滤,以除去其中的脂类物质及其他不溶性物质。收集滤液并放入500mL烧杯中。 
(3)检查滤液的pH值是否为3.5,若相差大,则应调回到pH3.5,置冰箱或冰浴下冷却片刻。 
(4)在冰浴下缓慢加入3倍体积的冷丙酮,用玻璃棒轻轻搅匀,用塑料薄膜盖好,以减少丙酮的挥发。在冰浴中放置2h。 
(5)倾出部分上清液,其余全部转移**离心管中,3 000 r/min,4℃离心15 min,倾出上清液,将离心管底部的沉淀物放在真空干燥器内,抽气,除去残留丙酮,然后用5 mL蒸馏水溶解。若溶解液混浊,可用滤纸去不溶物,将溶解液用Sephed-ex G-25层析柱脱盐或者透析除盐。 
2.凝胶层析对卵类黏蛋白提取液的纯化 (1)凝胶的预处理 
为使样品通过凝胶时流速稳定并得到很好的分离效果,应该对凝胶进行预处理。称取30 g Sephadex G-25凝胶,用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)500mL热溶胀2h或室温溶胀24h。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌,以防凝胶交联结构的破坏。上柱前将处理好的凝胶于真空干燥器中抽气20~30min。(2)装柱 
装柱是凝胶层析中**重要的环节,操作时凝胶必须装得十分均匀,中间不要有气泡。首先必须将柱子垂直地安装好。取0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)40mL倒进柱内,待流出20~30mL后关闭柱子下端的螺旋夹。然后将脱气后的凝胶用玻璃棒沿壁小心地缓缓倒进柱内,尽量一次装完,以免出现不均匀的凝胶断层。待凝胶沉降4~5min后打开螺旋夹,待凝胶沉降**床高20㎝处,用吸管吸出过剩的凝胶。用50~100mL磷酸缓冲液(pH6.5)冲洗凝胶柱,使柱床稳定,然后在凝胶表面放一片干净的滤纸,以防加样时凝胶被冲起。特别要注意在任何时候都不要使液面低于凝胶表面,否则凝胶变干,并有可能产生气泡,从而影响液体在柱内的流动。上样前要用上述缓冲液平衡凝胶柱,待流出液在紫外分光光度计测出的280 nm吸光值小于0.02时,可停止平衡,开始上样。 
(3)上样 
为了获得较好的分离效果,上样量要小,**多不能超过床体积的25%~40%。加样前,关闭柱下端的螺旋夹,用移液管慢慢地吸走凝胶上层的缓冲液,待床面只留下薄薄一层液体时开始加样。用移液管吸取5mL鸡卵类黏蛋白的粗提液小心地加到凝胶床上。并取走盖在凝胶上的滤纸。打开柱下的螺旋夹,待样品完全进入凝胶后,加少量磷酸缓冲液润洗凝胶表面,待液体完全流进床内后,关闭螺旋夹,开始洗脱收集。 
(4)洗脱 
在贮液瓶中加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.5),控制滴加速度,保证凝胶上方液面高度为10㎝。用下口螺旋夹调节流速为0.2~0.5mL/min,打开分部收集器每10min收集一管(3mL/管),用紫外分光光度计测定各管收集液的OD280值,以管号为横坐标,OD值为纵坐标绘出洗脱曲线,并收集蛋白峰。
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