Ni2+柱层析方法介绍

2.5.1 重组蛋白粗酶液的获取 
(1) 挑取重组大肠杆菌菌落于LB Amp+培养基中,30oC培养,230rpm。 (2) 按1:100比例接种到新的LB Amp+培养基中,30oC培养,230rpm, OD600≈0.6时开始诱导,IPTG终浓度为0.75mmol。 (3) 诱导7h后,4oC,5000g,5min离心收集菌体; 
(4) 菌体用灭菌ddH2O重悬洗涤,4oC,5000g,5min离心收集菌体; (5) 用1×binding buffer重悬菌体,采用超声破碎法破碎菌体; (6) 超声破碎液于4oC,30000g,离心20min收集上清备用。 2.5.2 Ni2+柱的活化 
(1) 充分悬浮柱填料保存液,取2mL装入柱中,静置(柱体积CV:1.5mL); (2) 设置柱流速10CV/h,待柱中保存的20%乙醇流**柱顶部时,加入3CV ddH2O洗柱; 
(3) 待柱中ddH2O流**柱顶部时,加入5CV 1洗柱1×charge buffer; 
(4) 待柱中1×charge buffer流**柱顶部时,加入5CV 1×binding buffer洗柱;柱 填料保存于1×binding buffer中。 2.5.3 重组蛋白的纯化 
以超声上清上样,分别用10CV 1×binding buffer、10CV 1×wash buffer、3CV 1×elute buffer、3CV 1×strip buffer洗涤层析柱,每1mL收集一管,4oC保存备用。 
 
1.3.4 Ni-NTA 系统缓冲液 
8×binding buffer :咪唑 40mmol/L , NaCl 4mol/L , Tris-Cl ( pH 7.9 ) 160mmol/L,加水**1000mL,调pH **7.9,配制8×binding buffer,工作浓度为 1×binding buffer。 
4×elute buffer:咪唑 4mol/L,NaCl 2mol/L,Tris-Cl (pH 7.9)80mmol/L, 加水**1000mL,调pH **7.9,配制4×elute buffer,工作浓度为1×elute buffer。 8×wash buffer:咪唑 480mmol/L,NaCl 4mol/L,Tris-Cl (pH 7.9) 160mmol/L, 加水**1000mL,调pH **7.9,配制8×wash buffer,工作浓度为1×wash buffer。 4×strip buffer:EDTA 400mmol/L,NaCl 2mol/L,Tris-Cl(pH 7.9) 80mmol/L, 加水**1000mL,调pH **7.9,配制4×strip buffer,工作浓度为1×strip buffer。 8×charge buffer:硫酸镍 400mmol/L,加水**1000mL,配制8×charge buffer, 工作浓度为1×charge buffer。

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