离子交换层析

离子交换层析(色谱) 一、原理 
       离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相,根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 
荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示:  
I — 流动相的离子强度,A和B为常数,     为离子强度无限大时溶质的分配系数,是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基:   阴离子:DEAE(二乙胺乙基); QAE(季胺乙基)     阳离子:CM(羧甲基);SP(磺丙基) 
    对于蛋白质等两性电解质,在物理意义上,B为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH偏离等电点的溶液中,蛋白质溶质的静电数常为两位数以上,故B值较大,即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下,不同蛋白质的分配系数相差非常大(几个数量级)。 洗脱方式: 
恒定洗脱法:洗脱液(流动相)的离子强度不变; 
缺点:对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法: 
        除GFC以外的层析操作均采用此种方法。 
        在洗脱过程中,流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大,因此溶质的分配系数连续降低,移动速度逐渐增大,使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下: (1)线性梯度洗脱法: 
优点:流动相离子强度(盐浓度)连续增大,不出现干扰峰,操作范围广; 缺点:需要特殊的调配浓度梯度的设备。 (2)阶段梯度洗脱法: 
优点:利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱,不需要特殊梯度设备,操作简单; 缺点:因为流动相浓度不连续变化,容易出现干扰峰。 
此外,容易出现多组分洗脱峰重叠的现象,因此洗脱操作参数(如盐浓度体积)的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 
GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 
 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC分离的特点: 
(1)料液处理量大,具有浓缩作用,可在较高流速下操作; 
(2)应用范围广泛,优化操作条件可大幅度提高分离的选择性,所需柱长较短; (3)产品回收率高; 
(4)商品化的离子交换剂种类多,选择余地大,价格也远低于亲合吸附剂。  
疏水作用层析(色谱) 一、原理 
疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相,根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 
二、疏水性吸附剂:将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 
常用的疏水性配基:苯基、短链烷基(C3~C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点: 
        疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性(疏水链长度)和配基密度成正比,故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异,疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在10 ~ 40mol/ml,配基修饰密度过小则疏水性吸附不足,密度过大则洗脱困难。  
三、HIC操作 
上样及洗脱的一般规律: 
    在高盐浓度条件下,蛋白质与固定相疏水缔合;浓度降低时,疏水作用减弱,逐步被洗脱下来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如(NH4)2SO4]。盐的浓度影响蛋白质的疏水性,从而影响蛋白质的保留值。 
盐:Na2SO4,KH2PO4,NaHPO4,(NH4)2SO4,NH4OAc,KOAc,NaOAc,NaCl                                             --〉 盐析作用增强 《--   洗脱能力增强      
1、影响疏水性吸附的因素   蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多,不易定量掌握。除疏水性吸附剂的性质(疏水性配基的结构和修饰密度)外,流动相的组成以及操作温度对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响。 
(1)离子强度及种类   蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大。离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。疏水性吸附与盐析沉淀一样,在高价阴离子的存在下作用力较高。因此HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相,在略低于盐析点的盐浓度下进料,然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。 (2)破坏水化作用的物质 
               ,      ,和  等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互作用。这类阴离子与上述盐析作用强的高价阴离子(如     ,     等)的作用正好相反,前者称为离液离子(chaotropic ion),后者称为反离液离子(antichaotropic ion)。在离液离子存在下疏水性吸附减弱,蛋白质易于洗脱。 

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