层析技术总结介绍

1. 介质:如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。 
葡聚糖凝胶(sephadex):较强吸水性,与交联度成反比。 
应用范围:分级分离各种抗原与抗体;去掉复合物中的小分子物质,如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片;分析血清中的免疫复合物;分子量的测定。 商品:SephadexG,G值与交联度成反比。 颗粒越细,流速越慢,分离效果越好。 丙烯葡聚糖凝胶(sephacryl):反压低,机械性能好,分离速度快,分辨率高,理化稳定,在SDS、6M盐酸胍、8M尿素中均可使用。 
应用范围:精细分离与纯化;去掉溶液中的小分子物质,如除盐、细胞色素及水解的蛋白质碎片;去除蛋白溶液中的热源类物质;分离蛋白、多糖与核酸;分子量的测定。 型号:S-100HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S- 500HR、S-1000SF。 分离范围:M1×103~M1×108。 聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-Ge1P):完全惰性,适合蛋白、核苷(酸);酰胺键遇强酸水解。 使用范围:pH2~11。 琼脂糖凝胶(sepharose):孔径大、机械强度好、流速快,只适大分子如病毒颗粒的分离,强酸强碱能引起结构破坏,不耐高温,**好使用条件控制在pH 4~9之间,温度0~40℃。 Superdex(Pharmarcia公司,目前**佳凝胶过滤介质):流速快、反压低、非特异性吸附低、样品回收率高、理化稳定(0.1mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH中40℃保温400小时分辨力保持不变,1% SDS、8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍能保持良好的色谱性能)。 适应范园:大分子精细纯化。 常见种类及参数:

2. 基本操作流程: 
凝胶选择: 
eg.除盐,粗中粒G-25/G-50 凝胶预处理: 
eg.G系,溶胀,过量缓冲液,冰箱/室温/沸水;S系,除去保存液中乙醇。除气泡,加热/抽真空。 
将干胶往水里加,边加边搅,以防凝胶结块,然后放到沸水浴中加热接近100℃,几个小时就可以使其溶胀,还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。但应注意尽量避免在酸或碱中加热(测pH),以免凝胶被破坏。 
层析柱选择: 
与样品量与分辨率相关,蛋白纯化,柱体积为样品体积的25~100倍,去盐等小分子,柱体积为样品体积的4~10倍;分辨率与长度成正比,长度一般<100cm,直径与长度范围(1:25~1:100),蛋白纯化为1:20~1:100,去盐等小分子为1:5~1:25,求高分辨率,可串连使用。 层析柱安装: 
检测各部件完好性→介质的水混合液搅拌均匀→装柱前层析柱底部灌水→装填(将层析柱与地面垂直
固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,使其自然沉降,等凝胶沉降约2-3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉积,这样凝胶粒水平上升,待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口,通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5~1 mL/min),始终保护凝胶上端有一段液体,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面)
→流动平衡(装填后放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速,千万不能超过**终流速。平衡凝胶床过夜)→落柱头(小体积,流速压力判断,大体积,可接压力表)
层析柱鉴定: 
实验室用:肉眼观察均匀、无纹路、无气泡,有色物质如蓝色葡聚糖-2000(2mg/mL)、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况较好,可以使用;如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱。 生产中:用测量层析柱柱效及对称性的来检定层析柱是否可投入生产中使用。 注:新凝胶柱可以能过提高缓冲体系中盐离子的浓度来降低非特异性吸附的程度。 层析柱的处理: 
一般为20%柱床体积的0.5M NaOH,有特殊要求下**多50%柱床体积,流速参考介质使用说明书。 平衡: 
平衡液为各药品自身缓冲体系,体积大于3个柱床体积,流速参考介质使用说明书。 注:缓冲体系要求不严格,只要不使物质变性。 上样: 
加样前去除样品中的不溶物,样品浓度与分配系数无关,查粘度影响运动。 加样要求快速均匀,加样体积,分级分离时为柱体积的1%~5%,分组分离时为柱体积的10%~30%。 洗脱: 
洗脱液与膨胀一致,为防止凝胶可能的吸附作用,洗脱液需一定的离子强度和pH值,洗脱速度得恒定,可参考说明书。 样品收集: 
分离型,采用5段法:缓峰、急峰、峰尖、峰后、尾峰。 脱盐,只需收集一个样品。 后处理: 
同层析柱的处理一致,用约20%的柱床体积的0.5M的NaOH进行处理。 封柱: 
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