纸层析法介绍

摘要:纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法,其原理主要是利用混合物中各组分在;流动相和固定相的分配比(溶解度)的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相(滤纸纤维常能吸20%左右的水),有机溶剂如乙醇等为流动相,色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上,当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下,连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时,试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动,并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快,移动距离较远;分配比较小的物质移动较慢,移动距离较近,试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上,从而达到分离。  
关键词:纸层析,分离,速度  
前言:层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。  
1.原理 
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成:一是固定相,它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分;另一是流动相,即可以流动的物质,如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒(流动相)通过固定相时,由于各组份的理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,在两相中的分配(含量对比)不同,而且随溶媒向前移动,各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份,随流动相移动时受到的阻滞作用小,向前移动的速度快。反之,与固定相相互作用越强的组份,向前移动速度越慢。分部收集流出液,可得到样品中所含的各单一组份,从而达到将各组份分离的目的。 
2.应用与实践: 
(一)凝胶层析法 
  凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 
(二)离子交换层析法 
  离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 
(三)高效液相层析法 高效液相层析法(HPLC)是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上,引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高,可在室温下进行,应用范围极广,无论是极性还是非极性,小分子还是大分子,热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。 
高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致,因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。 (四)亲和层析法 
亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力,从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 
具有专一亲和力的生物分子对主要有:抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素(或药物)与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂,当含有混合组份的样品通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出,然后改变流动组成份,将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质,与基质共价连接的化合物称配基。   亲和层析纯化过程简单、迅速,且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象,制备专一的配基和寻求层析的稳定条件,因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。 
  亲和层析可用于纯化生物大分子:稀溶液的浓缩;不稳定蛋白质的贮藏;从纯化的分子中除去残余的污染物;用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子;分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。 
 
(五)聚焦层析法 
  聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程,因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡,然后用多元缓冲液进行洗脱,多元缓冲液pH呈梯度下降。

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