关于蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍

从个人学术性实验室到大型的医药制造企业,小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年,但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的,经过时间考验的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是... 
关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂 
  从个人学术性实验室到大型的医药制造企业,小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年,但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的,经过时间考验的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration,GF),离子交换层析技术(ion exchange,IEX),羟基磷灰石层析(hydroxyapatite,HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction,HI),以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography,HPLC)。   对于一个初接触蛋白纯化的新手而言,从哪儿下手也许是令人头疼的一件事,但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道,通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步:   捕获——从细胞其它成份,比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 
  区分——从与目的蛋白具有相近的大小,或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 
  修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 
  这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和**佳的beads大小。 
  **步捕获步骤,也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白,这需要一个具有高容量和高流量(flow rate)的填料。bead大小比较大,范围比较宽(比较于bead大小平均值)的“fast flow”填料比较理想,这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。   第二步则对分辨率要求更高,需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比,因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术,比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤,而凝胶过滤则会留到了**后的修饰那一步,用于小体积,高浓度的样品。另外要注意,进行凝胶过滤层析时,样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 
  选择柱料的时候有两个因素要考虑到,针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力,IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用,而GF的选择性依赖于填料的分馏范围(fractionation range)。 
  柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力,Mitchell表示,“如果你的峰值不集中,比较宽,那么即使是选择性很好,分辨率仍然会被消弱”。bead越大,洗脱峰就越不集中,柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性,高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 
  凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 
  凝胶过滤法(gel filtration)也称为排阻层析(exclusion chromatography)、凝胶层析(gel chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatofraphy),它是在1960年后发展出来的技术。 
  凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,内部具有网状筛孔,利用球状凝胶内的筛孔,使分子流过填充凝胶的管柱时,大分子无法进入凝胶筛孔,而只流经凝胶及管柱间的孔隙,很快就可以流出管柱,较小的分子因为进入凝胶内的筛孔,故在管柱内的停留时间较长,由此区分大小不同的分子,亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下,凝胶不会吸附成份,所有欲分离物质都会被洗出,这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。 目前常用的凝胶包括3个主要类型:   1. Polydextran 
  Polydextran的商品名称是Sephadex,它几乎不溶于溶剂中,亲水性强,能迅速在水和电解质溶液中膨胀,在碱性的环境中十分稳定,所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号,如 G-25、G-75、G-100或是G-200,G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10,以G-25为例,表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。 
  GE的Sephadex G-25柱就是这一系的产品,十分适合于快速处理不同体积的样品,可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段,即适用于实验室操作,也可以在生产上应用。达柱体积30%的样品可通过简单的一次性上柱,脱盐并转换道新的缓冲液中,一些不需要的低分子量的物质,如盐分子就被洗脱了,这种产品**大的特点就是高速和高容量,处理起样品来快速高效。   2. Polyacrylamide 
  Polyacrylamide是一种合成凝胶,商品名Bio-Gel P,干粉颗粒状,在溶剂中自动溶成胶体,依胶的分离范围不同,分成Bio-Gel P-2**Bio-Gel P-300,P后面的数字乘以1000为**大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼,但它在极端的pH 下会被水解,水解后产生的COOH-具有离子交换的性质,因此pH 值应尽量控制在2-10之间。   3. Agarose 
  商品名Separose,属于天然凝胶,依凝胶中干胶的百分含量,分为Sepharose 2B,4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶,主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质,因其颗粒软,在分离过程有时会阻塞管柱,造成流速减慢,又因其在摄氏50度以上会融化,故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥,所以要在湿态中保存。凝胶和管柱的选择: 

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