Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质 介绍

一. 实验原理 
凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以**后流出;而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。 二. 试剂器材 
Sephadex G-75粉末 
洗脱液(10mmol/L Tris,10mmol/L NaCl,pH8.0):取Tris 1.2114g和NaCl 5.844g分别溶于适量的蒸馏水中,将两种溶液合并,用4mol/L的盐酸溶液调节pH值**8.0,再用蒸馏水定容**1000mL; 
其他器材:18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等 三. 操作步骤 凝胶的制备: 
称取Sephadex G-75粉末20g,加双蒸水400ml浸泡,置于水浴锅中加热**100℃,保持温度3hr,冷却**室温抽真空30min以排除气泡,待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒;装柱: 
取洗净的内径18mm,长为490mm的层析柱,管底内部放置一层丝网,将层析柱垂直,关闭出水口,加入1/2柱体积的双蒸水,然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中,同时打开出水口,使凝胶自然沉降; 平衡: 
凝胶床用洗脱液平衡过夜,约2个柱体积; 加样: 
称取样品溶解于5mL的洗脱液中。先吸去床面上层多余的洗脱液,余2-3mm,关闭柱出口,将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入,打开柱出口,让样品渗入凝胶床内; 洗脱: 
待液面与床面持平时,先用少量的洗脱液冲洗内壁,再用洗脱液进行洗脱; 收集: 
用分部收集器收集洗脱液; 蛋白浓度检测: 
用分光光度计以280nm波长紫外光检测各试管溶液的吸光值。 四. 注意事项 凝胶的特性要点 
葡聚糖G后面的数字代表不同的交联度,数值越大交联度越小,吸水量越大,其数值大致为吸水量的10倍。Sephadex对碱和弱酸稳定(在0.1mol/L盐酸中可以浸泡1-2小时)。在中性时可以高压灭菌。不同型号中又有颗粒粗细之分。颗粒粗的分离效果差,流速快。颗粒越细分离效果越好,但流速也越慢。交联葡聚糖工作时的pH稳定在2-11的范围内。葡聚糖G型凝胶分离的分子量分级范围为700-8×105。 凝胶的溶胀  
G系交联葡聚糖凝胶亲水性强,只能在水中溶胀(仅有少量的有机溶剂也可以使之溶胀),有机溶剂或含有有机溶剂较多的水溶液会改变其孔隙,使之收缩失去或降低凝胶的分离能力。在水中溶胀时如在室温则需要较长时间,才能达到充分溶胀的程度,但可煮沸到100℃,以缩短其溶胀时间。

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