氨基酸的纸层析法浅谈

一、目的 
了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。  
二、原理 
以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 
将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值) 
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 
用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以**次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 
本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 
 
三、实验仪器    1、 新华滤纸    2、 层析缸    3、 细线    4、 点样管    5、 橡皮筋    6、 电吹风    7、 喷雾器  
四、实验试剂 
1、混合氨基酸溶液(甘氨酸,苯丙氨酸),甘氨酸溶液,苯丙氨酸溶液 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中  
 
五、试验步骤  
1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画一圆点(原点)。 
2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。 
   3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层**另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。    4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。    5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。    6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。 
   7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看) 
 
六、实验结果 
1.标准氨基酸单向上行层析法 定性、定量测定: 
将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 
甘氨酸层析点中心到原点的距离:0.4cm 苯丙氨酸层析点中心到原点的距离:3.2cm 原点到溶剂前沿的距离:10.8cm 
在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值) 
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037 Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296 

七、实验分析 
由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 
注意事项: 
1. 在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。防止扩散面积过大,使展层效果不佳或直接影响实验结果。否则分离不好,并且样品用量大,会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。 
2. 注意点样线要高于层析液面。防止点样氨基酸溶解于层析液中。滤纸不要贴在层析缸璧上。防止滤纸左右两端展层速度过快,影响实验结果。 
3. 均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。 
4.取滤纸前,要将手洗净,这是因为手上的汗渍会污染滤纸。并尽可能少接触滤纸。在整个操作过程中,手只能接触滤纸边缘,否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上,不可放在试验台上,以防止污染。 
5.展层结束后,切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 6.在点样时,不要将毛细管插错了试剂瓶。 
7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。 8.风温度不宜过高,否则斑点变黄。  9.影响Rf值的因素有: 
    ①物质本身的化学结构;     ②展层所用溶剂系统;     ③展层剂pH值;     ④展层时的温度;     ⑤展层所用滤纸; 
客服电话
  • 15157563004
  • 15258505380