凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质介绍

一、实验目的 
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 
凝胶层析又称凝胶过滤,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。 
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即: 
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 
在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav值增大。 
Ve(洗脱体积)为某一成分从加入样品算起,到组分的**大浓度(峰)出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质,它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大(为200万),呈蓝色,它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻,并可借助其本身颜色,采用肉眼或分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)洗脱体积(即Vo)。但是,在测定激酶等蛋白质的分子量时,不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积,因为它对激酶有吸附作用,所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积,称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积,称内水体积,Vi=Vt-Vo。测定内水体积(Vi)的物质,可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯,或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 
Kav是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的Kav=0时,意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而**先被洗脱出来,即Ve=Vo。当某种成分的Kav=1时,意味着这一成分完全不被排阻,它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中,而**后被洗脱出来,即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质,其0﹤Kav﹤1,在中间位置被洗脱。可见,Kav的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 
本实验采用葡聚糖凝胶G-75作固相载体,可分离分子量范围在2000~70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白(M.W.=67000)和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时,两种物质因Kav值不同而被分离。 三、仪器与试剂 
1.器材:层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 
  (1)标准蛋白 
      a.牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)       b.溶菌酶:Mw =14,300   (2)洗脱液:0.9% NaCl溶液 (3)蓝色葡聚糖-2000、葡聚糖凝胶Sephadex G-75。 四、实验内容 
(一)凝胶的前处理(已做好) 
将Sephadex G-75置烧杯中,加入洗脱液于室温溶胀2~3天,反复倾泻去掉细颗粒,然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气,沸水浴中煮沸2~3小时(可去除颗粒内部的空气及灭菌)。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌,以防凝胶交联结构的破坏。 (二)装柱(已做好) 
取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在柱中注入洗脱液(约1/3柱床高度),将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中,待凝胶沉积约1~2cm 高度后打开出水口,使凝胶沉降,并不断加入凝胶浓浆。注意装柱过程中注意凝胶不能分层。 (三)平衡 
装柱完成后,接上恒流泵,以0.9%的氯化钠为流动相,以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度开始洗脱,用1~2倍床体积的洗脱液平衡,使柱床稳定。(实验中平衡1hr) 
(四)凝胶柱总体积(Vt)的测定。 
平衡完毕后,测定凝胶柱床的高度,计算柱床总体积Vt(凝胶柱直径为1 cm或1.6cm)。 (五)V0的测定 打开出水口,使残余液体降** 与胶面相切(但不要干胶),关闭出水口。用细滴管吸取0.2ml(4mg/ml)蓝色葡聚糖-2000,小心地绕柱壁一圈(距胶面2mm)缓慢加入,打开出水口(开始收集!),等溶液渗入胶床后,关闭出水口,用少许洗脱液冲洗2次,待渗入胶床后,再在柱上端加满洗脱液,开始洗脱,作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始**洗脱液中蓝色葡聚糖浓度**高点(肉眼观察)的洗脱液体积即为V0。 
蓝色葡聚糖洗下来之后,还要用洗脱液继续平衡1~2倍床体积(实验中平衡1hr),以备下步实验使用。 (六)上样、洗脱  
将柱中多余的液体放出,使液面刚好盖过凝胶,关闭出口。用移液管吸取0.5mL蛋白质混合液小心地加到凝胶床上,打开出水口,待样品完全进入凝胶后,加少量洗脱液冲洗柱内壁2次,待液体完全流进床内后,关闭出水口。在柱上端加满洗脱液,打开恒流泵,开始洗脱收集,6min一管。用紫外分光光度计测定各管收集液的OD280值,以洗脱体积为横坐标,OD值为纵坐标绘出洗脱曲线。 (七)凝胶柱的处理(不做) 

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