氨基酸 聚酰胺薄膜层析介绍

实验目的 
1、掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。 2、熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。  
实验原理 
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl,简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质),DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。 
DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物,其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定,可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析,灵敏度可达10-10~10-9mol水平,比茚三酮法高10倍以上,比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作,可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时,除DNS-色氨酸全部被破坏,DNS-脯氨酸(77%),丝氨酸(35%),甘氨酸(18%),丙氨酸(7%)部分被破坏外,其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。 
DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应,前两者在酸碱条件下均不稳定,酸水解时完全破坏;DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定,同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成,层层后在层析图谱的位点上,都与DNS-α-氨基酸有区别。 
聚酰胺是—类化学纤维原料,即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团,故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用,这是由于聚酰胺的一C=O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键;硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱,确定吸附能力的差异。在层析过程中,层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂,使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异,经过吸附与解吸的展层过程,可以一一分离。  
实验器材及试剂 
器材:聚酰胺薄膜(7cm×7cm)、小钟罩、吹风机、小离心管、毛细管、紫外分析仪、小培养皿、移液枪 
试剂:pH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸,混合氨基酸;展层液(以甲酸:水==1.5:100配制)
 
操作方法 
1、DNS-Cl标记PH9.9的标准氨基酸 
    取4个小离心管,分别加入三种标准氨基酸以及混合氨基酸各30微升,在各加入30微升DNS-Cl丙酮溶液,充分混合。然后将4个离心管在37度水浴中保温1h。 2、点样 
    在距边0.5cm处画一基线,在上面每隔1.5 cm画—点作为点样位置。用毛细管取样,点在聚酰胺薄膜点样位置上,点样直径不得超过2mm,若需要多次点样时,应当将**次样品点吹干后,再点第二次。 3、展层 
将点完样的聚酰胺薄片光滑面向外,聚酰胺面向内,箍以线圈或胶片圈(将旧的35 mm照相底片在1 mol/L氢氧化钠溶液中煮沸4小时,然后用水冲洗干净,做成小箍即可用)。展层容器用小干燥器或小钟罩,内放一小培养皿,倒入5-10 mL展层溶剂进行展层,以溶剂前沿走到距边约0.5cm为度(约10~20分钟),取出薄片,然后用吹风机吹干。 4、透射 
将聚酰胺薄膜**于紫外分析仪中,观察荧光斑点。  
实验结果 
                
实验结果图谱(铅笔勾线)(从左到右依次为丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、混合样品)  
注意事项 
1、水浴时检查水浴锅是否漏水,若漏水应及时处理。2、向离心管中加入氨基酸时要做好标记,以免弄混。 
3、实验中要保护好聚酰胺薄膜,拿的时候要拿光滑面,粗糙一面不得沾水污染,也不得有划痕,否则会影响实验结果。 
4、点样时注意毛细管的内径,若是1mm则点样一次,若是0.7或0.8mm则点样2到3次。 
5、每次点完样要用电吹风的冷风吹干。 6、点样的直径**好不要超过2mm。 
7、展层时注意展层液液面不能高过点样处,否则样品会溶于展层液。薄膜在展层液中应保持直立,不可卷曲成漏斗状,否则会使样品路径不平行,影响准确性。 8、圈画斑点时要戴手套,隔着玻璃观察,防止紫外线伤害。  
分析讨论 
1、水浴时要确保离心管与架子卡死,否则会使离心管漂在水面上,影响水浴效果。离心管的盖子也要盖好。 
2、点样时毛细管碰一下薄膜即可,若接触时间过长会使点样的直径过大。点样间的间距控制在1到1.5cm,太近可能会有样品重叠。点样应处于一条线上,该线距离膜端0.5cm左右。点样前可用铅笔画一条直线,画线时力度不可过重,否则影响实验。点样的力度也要控制好,不可用力过猛。 
3、展层时薄膜用橡皮筋束缚成半圆状立于装有展层液的平皿中。建议使用两个橡皮筋捆绑,否则容易使薄膜卷曲变形。用棉线绑薄膜更好,因为橡皮筋可能会带有某些有机物,产生多余的斑点。 

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