血红蛋白凝胶过滤层析介绍

摘要:本实验利用凝胶过滤的特点,先向层析柱中加入FeSO4 溶液,形成一个还原带,然后加入血红蛋白样品(血红蛋白与高铁氰化钾的混合液)。由于血红蛋白分子量大,在凝胶床中流速快,当其流经还原带时,褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移,与缓冲液溶解的O2 结合,形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物,呈黄色带远远地落在后边。这样,就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。 关键词:凝胶柱,抗凝血,磷酸缓冲溶液 
凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法,又称分子筛层析或排阻层析。目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类,即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物,内部有很微细的多孔网状结构。以Sephadex为例,它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物,网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大,则交联度越大,凝胶的网眼越小。Sephadex有很强的亲水性,在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大,网眼越小,吸水量也越少。本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离,通过层析柱可以形象的看见分离的过程。 1、实验材料及试验方法 
1.1实验仪器:烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸 1.2实验试剂 
(1)磷酸缓冲液(PH 7.0):称取Na2HPO4·2H2O 2.172g,NaH2PO4·2H2O 1.076g,溶于蒸馏水中,定容**1000mL。 
(2)Na2HPO4-EDTA-Na2 溶液:称取2.69g EDTA-Na2,3.56gNa2HPO4·2H2O,加蒸馏水溶解并定容**100mL。 
(3)40m mol/L FeSO4 溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中(用时现配)。 
(4)Sephadex G-25,或G-75 (5)固体铁氰化钾〔K3Fe(CN)6〕 
(6)抗凝血(哺乳动物血样,以1:6的比例加入2.5%柠檬酸钠,置于4℃冰箱中保存)。 1.3实验方法 
(1)凝胶溶胀(该步骤有老师在实验前准备) 
(2)装柱:将层析柱垂直固定,旋紧柱下端的螺旋夹,在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀,然后边搅拌边倒入层析柱中,同时开启螺旋夹,控制一定流速。**好连续装完凝胶,若分次装入,需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶,以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床**少长30cm,使胶床表面保持2-3cm液层。 
注意:整个操作过程中凝胶必须处于溶液中,不得暴露于空气,否则将出现气泡和断层,应当重新装住。
(3)平衡:继续用磷酸缓冲液洗脱,调整缓冲液流速,平衡20-30分钟。 
(4)样品制备: 
①取1ml鸡的抗凝血放入小烧杯中,加5ml pH7.0 的磷酸缓冲液,再加入27.5mg K3Fe(CN)6 固体,用玻棒搅动使其溶解,即得褐色的高铁血红蛋白溶液。 
②吸取 1ml FeSO4 溶液和 1ml EDTA-Na2-NaHPO4 溶液,于小烧杯中混匀。(注意:还原剂混合液要新鲜配制,尽可能缩短其与空气接触的时间)。 
(5)上样:旋开层析柱上端旋扭,待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶(即缓冲液液面与胶床平面相切)时,立即加入0.4ml上述混合液,待其进入胶床表面仅留约1mm液层时,加入0.5ml缓冲液,再当胶床表面仅留约1mm液层时,吸取0.5ml血红蛋白样品溶液,小心地注入层析柱胶床面中央,注意切勿冲动胶床。慢慢打开螺旋夹,待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm 液层时,用乳头滴管加入少量缓冲液,使剩余样品进入胶床,然后用液管小心加入3~5cm 高的洗脱缓冲液。 
6.洗脱:继续用磷酸缓冲液洗脱,调整流速,使上下流速同步保持每分钟约6滴。 
7.凝胶的回收:实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净,保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。 2、实验结果与分析 
从实验过程可以清楚滴看见凝胶过滤的分离效果。当装柱完成后,首先加入的是磷酸缓冲液,洗脱一定时间后,再加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液;此时凝胶柱内会有一段黄色带,当此黄色带再磷酸缓冲液的洗脱下完全进入凝胶柱内后,再加入的是血红蛋白样液,这时可以看见之前的黄色带上面是紧跟着的是红色条带;再当此红色条带完全进入凝胶柱内后,继续用磷酸缓冲液洗脱,可以看见,红色条带会慢慢下移,然后与黄色条带重合,之后再超过黄色条带,以较快速度继续向下移动,整个过程可以清楚的看见红黄两个明显的条带。**后,红色条带会先于黄色条带被洗脱出来。将洗脱出来的红色洗脱液与之前配制的高铁血红蛋白(稀释10倍)分别进行扫描,得到的曲线如下:

②此为高铁血红蛋白稀释10倍后扫描所得曲线 3、讨论 
    现将具体分析实验现象。本实验利用凝胶过滤的特点,当加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液时,首先形成的是一个还原带,加入血红蛋白样液(此样液即是血红蛋白与高铁氰化钾的混合液)后,由于血红蛋白分子量大,在凝胶床中流速快,当其流经还原带时,褐色的高铁血红蛋白立即变为紫色的亚铁血红蛋白,亚铁血红蛋白继续下移,与缓冲液中溶解的氧结合,形成鲜红的氧合血红蛋白,而铁氰化钾分子量小,呈黄色带远远地落在了后面。试验过程中红色带在穿越黄色带的前后颜色变化并不明显,但还是可以明显的将黄色带与红色带区分开来。
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