层析浅谈

层析技术,亦称色谱技术:  是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在两个相中,其中一个相为固定的(称为固定相),另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动,从而达到分离。层析法是近代生物化学**常用的分析方法之一,运用这种方法可以分离性质极为相似,而用一般化学方法难以分离的各种化合物,如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 
1.  层析的分类 
1.1  按分离相状态分类 : 
   根据层析过程中的固定相和流动相进行分类,大致可以分以下几类 : (1)气相层析是以气体为流动相的层析方法,称之为气相层析。 
   根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质,后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。  
(2)液相层析是以液体为流动相的层析方法,称之为液相层析。 
   同理,根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。 
(3)超临界层析是以流体为流动相的层析方式,称为超临界层析(SFC)。 
   它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的,这种分离方法更具专一性。  
1.2  按层析的分离机理分类  
(1)排阻层析(exclusion chromatography)  
   利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小,在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法,称之为排阻层析。如下图所示 



(6)金属螯合层析(metal chelating chromatography)      
    利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用,结合在固定相上,二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法,称之为金属螯合层析。如下图所示

(8)反向层析(reverse phase chromatography)   
     利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基,在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用,以非极性配基为固定相,极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法,称之为反相层析。 
 (9)聚焦层析(focusing chromatography)   
    利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子,在层析过程中所形成的pH梯度,并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法,称之为聚焦层析。 (10)灌注层析(perfusion chromatography)    
    利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法,称之为灌注层析。 2.  常用层析技术 
 2.1  离子交换层析技术 
是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相,以蛋白质等样品为移动相,分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。   2.1.1  原理 
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团,当结合阳离子基团时,可换出阴离子,则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基(Dicthylaminoethyl,DEAE)纤维素。在纤维素上结合了DEAE,含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H,它的反离子为阴离子(如Cl-等),可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时,可置换阳离子,称为阳离子交换剂,如羧甲基(Carboxymethy, CM)纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离
子(纤维素-O-CH2-COO一
),其反离子为阳离子(如Na+等),可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时,静电荷为0,当溶液pH值大于蛋白质等电点时,则羧基游离,蛋白质带负电荷。反之,溶液的pH值小于蛋白质等电点时,则氨基电离,蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远,蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷,但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异,以白蛋白为**多,依次为球 蛋白,β球蛋白和γ球蛋白  
    在适当的盐浓度下,溶液的pH值高于等电点时,蛋白质被阴离子交换剂所吸附;当溶液的pH值低于等电点时,蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同,只要溶液pH值发生改变,就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附,从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 
    交换剂对胶体离子(如蛋白质)和无机盐离子(如NaCl)都具有交换吸附的能力,当
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