常用的层析方法介绍

常用的层析方法 
层析填料是决定拄效的主要因素。 填料应具有的性能是不溶于所使用的流动相中,不使欲分离的物质破坏或分解、惰性大,可逆性强,吸附容量大,同时颗粒直径范围要狭.因此在选择填料时事先应对其性能有充分的了解,下面将按常用填料名称分类介绍。    1  硅胶层析   (1)性质 
层析硅胶为一多孔性物质,可用通式Si02·xH20表示.它具有多孔性的硅氧环的交键结构,由于其骨架表面具有很多游离(I)、键合(Ⅱ)和键合—活性(III)状态的硅醇基·(silanol)基团它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用,同时能吸附多量的水分.当加热活化(100一110℃)时,硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去;但温度升高**500℃时,硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键即硅氧环表面(A)及稠合环氧环烷(B),从而丧失了因氢键吸附水分的活性不再具有吸附剂的性质.若用水处理亦不能恢复其吸附活性 
加热**1100℃时则结合水失尽.由于硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关,因此活化时不宜在较高温度进行,一般在170℃以上即有少量结合水失去.硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目,其次是含水量,它随着水分的增加而降低(表l—3).若吸水量超过12%,吸附力极弱,不能用作吸附层析,只可用作分配层析的载体.硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着层析分离的效果(生产都得测出型号).另一方面因它具有弱的非特异性吸附,能同样吸附极性、非极性饱和和不饱和分子,所以硅胶具有吸附层析与分配层析的双重性.同时硅胶又是一种弱酸,其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,解离常数为10 -6—10 -8,是一种弱酸性阳离子交换剂,当遇到较强的碱性化合物时,则可因离子交换作用而吸附碱性化合物。

硅胶表面的硅羟基能与各种醇如氰乙醇、正辛醇、聚乙二醇在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相(Si—O—C型),与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相(Si—O—Si—C型).  另外用S0Cl2将硅胶表面氯化后,与各种有机铵反应生成具有Si—O—Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相,这大大有助于提高分离选择,在液相色谱中占有极为重要的地位,并普遍用于高效液相层析. 
    层析硅胶应是中性无色颗粒,由于制备过程中接触强酸,常带有酸性,故在使用前应检查其水浸液的酸度,不低于pH5时才可使用.否则应用水洗**中性,再在110℃活化24h.在特殊情况下,硅胶须经6N*盐酸及氯仿等有机溶剂预洗,除去其中所含的铁离子及有机脂溶性杂质.硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性,约为0.01%.当溶液在pH9以上则溶解度急剧上升,此点在选择溶剂时应注意,否则会将流分中溶解硅胶误认为植物成分.  硅胶层析有时可以加入一种复合试剂,以改良吸附性能,提高分离效果.通常用硝酸银处理硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用.改良吸附剂制备一般用1—10%复合试剂的水或丙酮溶液,与硅胶混匀,待稍干后于110℃干燥即可. 
    硅胶层析适用范围广,能用于非极性化合物也能用于极性化合物,如芳香油,萜类,甾体,生物碱,强心甙,蒽酮类,酸性、酚性化合物,磷脂类,脂肪酸,氨基酸以及一系列合成产物等的分离.  (2)层析柱的制备与加样 
    硅胶装柱一般用湿法,即将硅胶混悬于装柱溶剂中,不断搅拌,待内中空气泡除去后,连同溶剂一起倾入层析柱中,层析柱中硅胶段直径与长度之比一般为1:20—30.  若硅胶的颗粒较细,而粒度分布范围狭,则可采用短柱(1:5),这样不仅增大了截面积,而且也增加了样品的载量.硅胶**好一次倾入,否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一,使硅胶柱有明显的分段现象,影响分离效果.另亦可采用干法装往,将所需硅胶一次倾入柱中,然后礅紧**硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1:30—60,若作为分配层析比例应加大,主要根据分离物质的难易采确定.  
当采用分配层析时,应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中,一般比例为1:0.5—1较为适中,搅拌混合均匀,倾入预先选定的移动相溶剂中并激烈搅拌,使两相互相饱和达到平衡.层析管中事先放入用固定相溶剂剧裂振摇饱和后的移动相,将上述吸着固定相的硅胶按湿法装柱,不断轻敲管壁,使均匀紧密.另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的移动相中,按湿法装柱,然后用固定相饱和的流动相通过硅胶拄,使达到层析时稳定的平衡条件. 
    样品上柱可采取二种方式,如样品能溶于移动相可用少量移动相溶解,从柱顶加入,尽可能保留加样色带狭,再行展开,如样品难溶于移动相,则可溶于适当的溶剂,拌于干燥硅胶上,待溶剂挥发尽后,加适量的移动相拌匀再上柱。并在上面覆盖一薄层纯净的砂,然后用移动相展开  (3)层析溶剂的选择 
    层析过程中溶剂的选择,对组分分离关系极大.一般没有可循的规律.通常是根据物质的极性度采用相应的极性溶剂来洗脱.在实际吸附层析中是采用从低极性逐步递增极性的梯度洗脱方式.溶剂的洗脱力随介电常数(表1—4)增高而加大.往往借助于硅胶薄层层析的结果来摸索分离条件,基本上可以套用于柱层析.两者所不同者在于样品与硅胶的用量比例,故通常往层析所用的溶剂比薄层层析展开剂极性略偏小.再者可参阅前人分离同类型物质时所用的溶剂系统条件.如采用分配层析可先用纸层析方法探索分离条件.
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