纸层析法测定叶绿素介绍

摘要:纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法,其原理主要是利用混合物中各组分在;流动相和固定相的分配比(溶解度)的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相(滤纸纤维常能吸20%左右的水),有机溶剂如乙醇等为流动相,色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上,当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下,连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时,试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动,并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快,移动距离较远;分配比较小的物质移动较慢,移动距离较近,试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上,从而达到分离。  
关键词:纸层析,叶绿素,分离,速度  
前言:初步掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。叶绿体中有几种色素。胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b随层析液在滤纸上扩散速度不同,可以分出四条色素带。  
材料和方法: (一)材料: 
用具:剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml量筒一只,天平一只,试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片    
试剂:丙酮、无水乙醇、层吸液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成)、二氧化硅、碳酸钙、碳酸钠    材料:新鲜的菠菜叶、青菜叶  
(二)方法和步骤: 
 1.提取绿色叶片中的色素 (1)取几片绿色的叶片,去掉叶柄和主脉,用天平称取 5g 叶片,剪碎,放 入研钵中。  
(2)向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙,进行充分的研磨。用量筒量取 5 ml 丙酮,倒入研钵中,迅速充分研磨。  
(3) 将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤。 将滤液收集到一个小试管中, 及时用棉塞将试管目塞紧。  
2.制备滤纸条 取一块预先干燥处理过的定性滤纸,将滤纸剪成长 10 cm、宽 1cm 的滤纸 条,在距滤纸条一端 1cm 处用铅笔画一条细的横线。  
3.画滤液细线、 用毛细吸管吸取少量滤液,沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待 滤液于后,再画 2~3 次。  
4.分离叶绿体中的色素 将 3 mL 层析液倒入烧杯中,将滤纸条(有滤液细线的一端朝下)略微料靠着 烧杯的内壁,轻轻地插入到层析液中,随后用培养皿盖盖上烧杯;(注意,不能让滤纸上的滤液细线触到层析液。纸层析法中所用的有机
溶剂如丙酮等,一般有挥发性、并有一定毒性,使用时要注意密封层析,避免吸入过多有害挥发物。)结果: 经过10—15分钟后,观察分离后色素带的分布。**上端橙黄色为胡萝卜素,其次
黄色为叶黄素,再下面蓝绿色为叶绿素a,**后的黄绿色为叶绿素b。  
讨论与分析: 
分析:纸层析法依据极性相似相容原理,是以滤纸纤维的结合水为固定相,而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同,因而扩散速度不同,从而达到分离的目的。一般用于叶绿体中色素的分离,叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、 
叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解度不同,溶解度大的随层析液在滤 纸上扩散地快,反之则慢;含量较多者色素带也较宽。**后在滤纸上留下4条色素带,所以利用纸层析法 能清楚地将叶绿体中的色素分离。 
讨论:1、 叶绿素等是脂溶性的有机分子,根据相似相溶的原理,叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。    
2、 叶绿素分布于基粒的片层薄膜上,加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成,使色素溶解于丙酮中。    3. 破碎的细胞中含有草酸等有机酸,叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合态,镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合,减少镁离子的转移,防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙,同时加入碳酸钠的道理亦如此。    
4、 在过滤时选用脱脂棉或纱布,而不用滤纸。原因主要有下:(1)色素分子比较大,不容易透过滤纸; (2)滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上,从而降低色素浓度,影响实验效果;(3)叶绿素是脂溶性,根据相似相容的原理,脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失,增强实验效果。    
5、 根据物理学中的毛细现象,画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理,是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话,会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管,而影响层析液的扩散。    
6、 由于液面的不同位置表面张力不同,纸条接近液面时,其边缘的表面的张力较大,层析液沿滤纸边缘扩散过快,而导致色素带分离不整齐的现象。故而,在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。    
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